Aurora Criado Montero
M.ª del Pilar Macía Rodríguez
Mariano Pazos Afonso
Antía Solloso Bañobre
IES A Sardiñeira (A Coruña)

Introdución

Seguindo na mesma liña de traballo doutros artigos publicados nesta revista, os profesores que asinamos este artigo consideramos que unha boa maneira de mellorar notablemente a calidade do ensino no noso ámbito, o da formación profesional, consiste en introducir no traballo co alumnado novas técnicas analíticas, innovadoras en investigación e tamén punteiras na actividade industrial actual.

É importante subliñar que a práctica con novas técnicas de análises vai depender enormemente da dispoñibilidade de equipos e de persoal disposto a dedicar horas de traballo, mesmo fóra do seu horario habitual, para conseguir a preparación necesaria co fin de, máis tarde, trasladar as súas experiencias á aula.

Con base no anterior, pensamos que sería interesante contar a nosa experiencia no desenvolvemento de innovadores métodos de análises que teñen a finalidade de achegar o alumnado ao mundo laboral real no ámbito da análise instrumental.

Esta nova experiencia que imos describir, e que esperamos que sirva de axuda para outros profesores que desexen embarcarse neste tipo de proxectos, é a determinación cualitativa dos compoñentes principais dos aceites esenciais dalgunhas especias. Isto é posible grazas á recente adquisición, por parte do centro educativo, dun cromatógrafo de gases con detector de masas: CG-MSD.

Obxectivos

• Introducir o alumnado dos ciclos de Química en novas técnicas analíticas, como é a cromatografía de gases axustada á espectrometría de masas.
• Utilizar un método sinxelo e eficiente de extracción dos aceites esenciais de diversas especias, como é a extracción asistida por ultrasón (EAU).
• Identificar os aceites esenciais extraídos por cromatografía de gases-espectrometría de masas.

Fundamento

Os aceites esenciais son mesturas de produtos naturais hidrofóbicos obtidos de plantas aromáticas. Os aceites extraídos son moi fragrantes e úsanse en cosméticos, alimentación, como insecticidas e na industria farmacéutica.

Poden ser extraídos de diversas formas (destilación con arrastre de vapor e extracción con diclorometano, extracción en fase sólida, extracción por Soxhlet etc.), pero nesta práctica vaise realizar unha extracción asistida por ultrasón (EAU): colócase un sólido no seo dun disolvente orgánico dentro dun baño de ultrasóns e sométese a sons de alta frecuencia, co que as partículas sólidas e líquidas vibran e se aceleran, e como resultado da acción ultrasónica o soluto pasa rapidamente da fase sólida ao solvente.

Se se reduce o tamaño das partículas do material vexetal, aumenta a área de exposición ao solvente e mellora a extracción. Por iso, nesta práctica vaise traballar preferentemente con especias moídas.

Unha vez extraídos os aceites esenciais, procédese a separar os seus compoñentes mediante a cromatografía de gases. A cromatografía de gases é unha técnica analítica que permite separar os compoñentes dunha mestura con base na súa diferente afinidade por unha fase estacionaria que tapiza o interior dunha columna, cando son arrastrados a través dela por unha fase móbil gasosa. Mediante esta técnica pódense separar, detectar e mesmo cuantificar os compoñentes da mestura,  pero o único dato de que dispoñemos para a identificación de cada un deles é o tempo de retención (tempo que tarda cada substancia en abandonar o sistema cromatográfico). Este dato non é suficiente para unha identificación inequívoca, sobre todo cando analizamos mostras cun número elevado de compoñentes.

A identificación inequívoca dunha substancia realízase utilizando un espectrómetro de masas. A espectrometría de masas é unha técnica microanalítica usada para identificar compostos descoñecidos, cuantificar compostos coñecidos, e para elucidar a estrutura e propiedades químicas das moléculas. Na espectrometría de masas a mostra é ionizada (e polo tanto destruída) mediante unha fonte de ionización (EI) que bombardea as moléculas da mostra con electróns de alta enerxía. A través deste proceso, a substancia perde algúns electróns e fragméntase, o que dá diferentes ións, radicais e moléculas neutras. Os ións (moléculas ou fragmentos cargados) son entón conducidos mediante un acelerador de ións a un tubo analizador curvado, sobre o que existe un forte campo magnético, e conducidos a un colector/analizador sobre o que se recollen os impactos dos devanditos ións en función da relación masa/carga (m/z) destes. Cada composto é único e cada un dos compostos ionizarase e fragmentarase dunha determinada maneira, e neste principio baséase a espectrometría de masas para identificar cada analito.

A espectrometría de masas pode identificar de maneira case inequívoca calquera substancia pura, pero normalmente non é capaz de identificar os compoñentes individuais dunha mestura sen separar previamente os seus compoñentes, debido á extrema complexidade do espectro obtido por superposición dos espectros particulares de cada compoñente. Polo tanto, a asociación das dúas técnicas, cromatografía de gases e espectrometría de masas, dá lugar a unha técnica combinada GC-MS que permite a separación e identificación de mesturas complexas.

Polo tanto, para a realización da práctica utilizaremos o equipo de Agilent Technologies que existe no laboratorio (Agilent 7820 GC /Agilent 5977 MSD).

Imaxe 1. Equipo CG-MSD modelo Agilent 7820 GC/Agilent 5977 MSD

Vanse empregar diferentes especias: canela moída, cravo, comiño moído, comiño de prado, aneto e carvea. Os compostos maioritarios contidos nos aceites esenciais destas especias son cinaldehido, euxenol e carvona. Polo tanto, dispoñeremos tamén dos patróns destes tres compostos.

 Imaxe 2. Algunhas especias utilizadas e parte do material para a realización da práctica               Imaxe 3. Patróns de cinaldehido, euxenol e carvona

Procedemento

A) EXTRACCIÓN DOS ACEITES ESENCIAIS

• 1. Pésanse 2 g de cada unha das especias (canela moída, cravo e comiño moído), colócase cada unha delas dentro dun tubo con tapón da rosca e engádese, cunha micropipeta, 5 ml de metanol e 10 ml de hexano. Mestúranse ben.

Imaxe 4. Granatario                                                                               Imaxe 5. Especias e disolventes

• 2. Sen pechar do todo os tubos, lévanse ao baño de ultrasóns para que permanezan alí 20 minutos a 50 ^oC.

Imaxe 6. Baño ultrasóns                                   Imaxe 7. Interior do baño de ultrasóns cos tubos que conteñen as especias

• 3. Fíltrase o extracto obtido, cunha xiringa e un filtro de nailon de tamaño de poro de 0,45 µm, e gárdase o filtrado de cada un deles nun tubo con tapón da rosca debidamente etiquetado.

Imaxe 8. Filtrado do extracto                           Imaxe 9. Extractos filtrados en tubos  pequenos

B) PREPARACIÓN DE PATRÓNS E MOSTRAS

• PATRÓNS: prepárase unha única disolución que contén os tres patróns (20 µl de carvona, 20 µl de cinamaldehído e  20 µl de euxenol en 1,5 ml de hexano), que etiquetamos como “patróns”.
• MOSTRAS: prepárase un tubo para cada mostra que contén 300 µl de extracto filtrado e 1,5 ml de hexano, que etiquetamos como “extracto_CA” (para a canela), “extracto_CL” (para o cravo) e “extracto_CO” (para o comiño).

Imaxe 10. Tubo cunha mestura dos tres patróns                                                          Imaxe 11. Preparación da mostra para inxección no CG-MSD

C) SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DOS COMPOÑENTES DO EXTRACTO DAS ESPECIAS

• 1. En el ordenador se abre el software MassHunter Data Acquisition y se carga el método que se ha desarrollado para esta práctica.

Las condiciones instrumentales optimizadas son las siguientes:

*Solvent delay:  tiempo durante el cual el detector de masas (MSD) no está funcionando, mientras el solvente eluye de la columna. Se usa para alargar la vida del filamento de la fuente de ionización.

• 2. Inxéctase 1 ml dos patróns e das mostras dos extractos individuais. Cando comeza a correr o método con cada un deles, na ventá de control do software pódese ver como vai aparecendo o cromatograma e a adquisición de datos das masas en tempo real.

Figura 1. Cromatograma e adquisición de datos en tempo real

• 3. Analízanse os cromatogramas e os espectros de masas obtidos en cada proba co software MassHunter Quantitative Analysis.

Resultados

Análise do cromatograma e dos espectros de masas dos patróns

Ao abrir co software MassHunter Quantitative Analysis o arquivo correspondente aos patróns, obtense o seguinte cromatograma:

 Figura 2. Cromatograma correspondente a unha inxección da mestura de patróns

Pódense observar tres picos cromatográficos, que loxicamente deben corresponder aos tres patróns presentes na mostra, o que comprobamos coa librería NIST MS (é unha base de datos de espectros de masas elaborada polo National Institute of Standards and Technology —O.S. Department of Commerce—, dispoñible por compra/subscrición en liña).

Para iso:

• Sobre o cromatograma, e cun clic dereito, intégranse e extráense os espectros de masas de todos os compoñentes:

Figura 3. Integración dos picos do cromatograma

Figura 4. Visión xeral da zona de traballo na aplicación de análise cualitativa (MassHunter Quantitative Analysis)

Como se pode observar, na ventá hai tres zonas diferentes:

• Na parte esquerda aparecen os datos relacionados co cromatograma (tempos de retención, altura e área dos picos cromatográficos) e os datos relacionados cos espectros de masas (relación m/z de cada fragmento e a súa abundancia).
• Na parte central atópase o cromatograma: as áreas encerradas baixos os picos atópanse subliñadas e sobre cada pico aparece o valor do tempo de retención.
• Á dereita aparecen os espectros de masas de cada compoñente: en cada un pódense observar a abundancia e a relación masa/carga dos diferentes fragmentos.

Se se pica co rato sobre un pico cromatográfico, na zona dereita aparece resaltado o espectro de masas correspondente a ese composto.

• Sobre un dos espectros de masas, e cun clic dereito, investígase na librería NIST MS a identidade dese composto:

Figura 5. Busca de que composto corresponde a cada pico do cromatograma. Realízase coa librería NIST

Como cada composto é único e mostra un patrón de fragmentación característico, o espectro de masas é como unha “pegada química” que nos permite identificalo. O que fai o software é comparar o noso espectro de masas cos espectros de masas de compostos patrón que se atopan na librería NIST MS e proporcionar o composto que máis probabilidades ten de producir ese espectro de masas. Así, co primeiro pico cromatográfico o software indícanos que se trata de carvona:

Figura 6. Resultado da busca do primeiro pico de cromatograma. Segundo a librería NIST, é carvona

Realizamos o mesmo procedemento cos demais picos, e obtense que o segundo pico corresponde ao cinaldehido:

Figura 7. Resultado da procura do segundo pico de cromatograma. Segundo a librería NIST, é cinaldehido

E o terceiro pico é o correspondente ao euxenol.

Figura 8. Resultado da busca do terceiro pico de cromatograma. Segundo a librería NIST, euxenol

Mesturáronse os tres patróns na mesma disolución porque coa librería NIST MS identificouse cada un dos picos obtidos no cromatograma. Se utilizásemos a CG utilizando outro tipo de detector, teriamos que inxectar no cromatógrafo cada patrón por separado, e poderíanse identificar nunha mostra problema estes compostos con base nos valores dos tempos de retención, sempre que se repetisen os mesmos parámetros na separación cromatográfica.

Análise dos cromatogramas e espectros de masas das mostras

• Extracto de canela

Abrimos á vez o arquivo correspondente aos patróns e o do extracto de canela e observamos o seguinte:

Figura 9. Comparación do cromatograma dos patróns co do extracto de canela

No cromatograma do extracto de canela obsérvanse varios picos, indicando que existen varios compoñentes no aceite de canela, pero hai un que é maioritario, e por comparación co cromatograma dos patróns parece ser o cinaldehido.

Verificamos a súa identidade coa librería, que nos indica que efectivamente é o cinaldehido.

• Extracto de cravo

Neste caso, no cromatograma obsérvanse dous picos cromatográficos.

Figura 10. Comparación do cromatograma dos patróns coa do extracto de cravo

Investigando na librería NIST MS resulta que o compoñente maioritario do aceite de cravo é o euxenol.

• Extracto de comiño

Como se pode ver no cromatograma, o aceite esencial de comiño é unha mestura de moitos compostos, aínda que un deles, o maioritario, presenta un tempo de retención similar ao da carvona.

Figura 11. Comparación do cromatograma dos patróns coa do extracto de comiño

Ao buscar na librería a que composto corresponde ese pico cromatográfico levamos a sorpresa de que se trata do cuminal.

Figura 12. Resultado do compoñente principal do comiño. Non é o que se espera (carvona)

Repetimos a análise por se se tratase dun erro, e novamente obtemos que o compoñente maioritario do comiño é o cuminal.

Fixámonos entón nos espectros de masas dos picos correspondentes á carvona en ambas as mostras (tempo de retención 8,015 nos patróns e 7,992 no extracto de comiño):

Figura 13. Espectro de masas da carvona

Figura 14. Espectro de masas do cuminal

E pódese ver como o patrón de fragmentación é diferente. O pico base, o máis intenso, ten unha relación m/z de 82,1 na carvona, mentres que no pico correspondente do extracto de comiño ten un valor de 133,1. Por outra banda, o ión molecular, o que resulta da perda dun só electrón por parte da molécula, ten unha relación m/1 de 150 na carvona e de 148 no pico do extracto.

Todo isto indícanos que non hai ningún erro na identificación e que son dous compostos distintos. 

Decidimos entón buscar en diferentes fontes de información cal é o compoñente principal do aceite de comiño e atopamos con sorpresa que a carvona é compoñente principal do “comiño de prado”, e que tamén forma parte dos aceites esenciais do aneto e da carvea.

Nun establecemento especializado en especias adquirimos os tres produtos (dinnos que o comiño de prado é diferente do comiño que se vende moído e véndennos un comiño en gran) e repetimos novamente a experiencia con eles.

Imaxe 12. Especias: aneto, comiño de prado e carvea

Analizamos os cromatogramas e espectros de masas dos extractos destas especias:

• Extracto de comiño de prado

Figura 15. Cromatograma do extracto de comiño de prado cuxo compoñente maioritario é o cuminal

O cromatograma obtido é similar ao do comiño moído. Mesmo se nos fixamos no espectro de masas do pico que presenta un tempo similar ao pico da carvona, vemos que o pico base ten unha m/z de 133,1, o que nos indica claramente que se trata do cuminal, e verificámolo coa librería.

• Extracto de aneto

Figura 16. Cromatograma do extracto de comiño de prado cuxo compoñente maioritario é o cuminal

Se marcamos cun clic dereito o pico que presenta un tempo similar ao da carvona, resáltase o espectro de masas deste composto á dereita da ventá, e comprobamos novamente que o pico base deste composto é o de 133,1, polo que se trata de cuminal. Verificámolo coa librería.

Obsérvase que o compoñente maioritario do aneto, cun tempo de retención de 6,150, é o pineno.

Figura 17. Resultado dalgúns compoñentes maioritarios do aneto: pineno

E o segundo compoñente maioritario é o terpineno.

Figura 18. Resultado dalgúns compoñentes maioritarios do aneto: terpineno

• Extracto de carvea

Figura 19. Cromatograma do extracto de carvea

Esta é a única especia en cuxo extracto se detecta a carvona (pico base de 82,1, como se pode apreciar á dereita da imaxe, e comprobado coa librería).

Ademais, como se pode ver no cromatograma, o aceite esencial de carvea extraído por EUA ten basicamente dous compoñentes: carvona e limoneno.

Figura 20. Resultado do compoñente maioritario da carvea: carvona

Conclusións dos resultados da análise

• Esta análise cualitativa dos aceites esenciais de especias conduciríanos a resultados erróneos se o realizásemos mediante a cromatografía de gases cun detector FID (detector de ionización de chama). Nesta técnica a identificación basearíase na aparición dos picos nos mesmos tempos de retención en mostras e patróns individuais e, como puidemos comprobar nesta experiencia, o tempo de retención pode ser similar en compostos de masa molecular e propiedades químicas similares, como sucede no caso da carvona (cetona de masa molecular 150) e o cuminal (aldehido de masa molecular 148).
• Esta mesma experiencia realizouse co alumnado do Ciclo de Laboratorio de Análise e Control de Calidade, pero modificando a técnica de extracción dos aceites esenciais: extracción mediante destilación por arrastre de vapor e por extracción cun equipo Soxhlet. Con ambas as técnicas se obtiveron os mesmos resultados ao analizar os aceites.

Polo tanto, pódese concluír que a extracción asistida por ultrasóns, que é un método sinxelo e rápido, resulta moi eficaz para a análise cualitativa de aceites esenciais de especias.

Conclusións

• A aprendizaxe desta técnica de análise foi extraordinariamente positiva, xa que permite identificacións sinxelas, con base na librería do software da que dispÓN o equipo, e abre un campo enorme de posibilidades analíticas no ámbito educativo da formación profesional dos ciclos de Química.
• O achegamento do alumnado a casos reais produciu no alumnado unha motivación extra.
• Conseguiuse que tanto alumnos como profesores manexasen sen medo equipos de bastante complexidade.
• Conseguíronse desenvolver dinámicas de traballo en grupo tanto para profesores como para alumnos, o cal ademais de enriquecedor é un aspecto formativo fundamental para encarar a vida laboral.
• Fomentouse unha actitude colaborativa entre profesores de distintos módulos, co fin de ampliar a súa perspectiva do ciclo formativo, adquirindo novas habilidades técnicas para o seu uso na aula.