Dr. Jorge Eduardo Regueiro Tato
Dra. Rosa María Domínguez Grela
Profesores de Análise e Química Industrial
CIFP Politécnico de Santiago (Santiago de Compostela - A Coruña)
jorge.regueiro@edu.xunta.es

1. Contextualización

No módulo de Análise Instrumental (MP0067) do ciclo formativo de grao superior de Laboratorio de Análise e Control de Calidade (SQUI01) que se imparte no CIFP Politécnico de Santiago, trabállase unha unidade didáctica sobre técnicas cromatográficas de análise na que se estudan a cromatografía de gases e a cromatografía líquida de alta resolución, entre outras. A cada vez maior implantación destas técnicas separativas no contorno profesional do técnico superior en laboratorio e control de calidade fai que o seu coñecemento sexa fundamental para o desenvolvemento pleno das súas competencias profesionais.
Nesta publicación recóllese a posta a punto e realización dunha práctica de laboratorio pensada para traballar os distintos contidos desta unidade didáctica e formar o alumnado deste e outros ciclos da familia Química no uso da cromatografía líquida de alta resolución. Parte dos resultados que se presentan a continuación obtivéronse ao longo de varias sesións prácticas levadas a cabo durante o curso 2018/19 co alumnado de Análise Instrumental, na súa modalidade modular.

2. Introdución

A cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC, do inglés High Performance Liquid Chromatography) é a técnica analítica de separación máis empregada na actualidade polas súas múltiples vantaxes (Skoog, Holler, & Crouch, 2008).
Introdución
Nesta técnica, unha mostra líquida ou ben unha mostra sólida diluída nun disolvente axeitado é transportada a través dunha columna cromatográfica pola acción dunha fase móbil. A separación ten lugar como consecuencia das múltiples interaccións que se establecen no seu percorrido entre o analito, a fase estacionaria e a fase móbil. Dependendo do tipo de cromatografía líquida, estas interaccións poden basearse en fenómenos de adsorción líquido-sólido, partición líquido-líquido, intercambio iónico ou exclusión por tamaños (Harvey, 2000).

A diferenza da cromatografía de gases (GC, do inglés Gas Chromatography), a cromatografía de líquidos permite a separación de especies non volátiles ou termolábiles, polo que presenta un rango de aplicacións moito maior. Na actualidade, o seu uso é habitual na determinación de multitude de analitos de diversa índole (fármacos, contaminantes, metabolitos etc.) en distintos tipos de matrices. No que se refire á análise de alimentos, a cromatografía de líquidos emprégase para a determinación de praguicidas, antibióticos, toxinas, aditivos alimentarios ou compostos funcionais, entre outros (Regueiro & Wenzl, 2015).

Neste traballo empregouse a técnica de HPLC con detección de ultravioleta (UV) para a determinación de cafeína e dunha serie de edulcorantes artificiais en refrescos sen azucre e bebidas enerxéticas. As estruturas químicas dos compostos analizados son as que se mostran na figura 1.

Figura 1. Estrutura química dos analitos estudados

3. Parte experimental

3.1. Reactivos, estándares e disolventes

Empregáronse os seguintes reactivos e disolventes:

    • Cafeína, pureza ≥ 99,0 %, Sigma-Aldrich.
    • Acesulfamo K, pureza ≥ 99,0 %, Sigma-Aldrich.
    • Aspartamo, pureza ≥ 98,0 , Sigma-Aldrich.
    • Sacarina, pureza ≥ 98,0 %, Sigma-Aldrich.
    • Auga, grao HPLC, Panreac.
    • 3.Acetonitrilo, gra o HPLC, Panreac.
    • Etanol, grao HPLC, Panreac.
    • Ácido acético glacial, grado HPLC, Sigma-Aldrich.

3.2. Materiais

Para o desenvolvemento deste traballo empregouse o seguinte material:

    • Material de vidro variado (vasos de precipitados, probetas e matraces aforados de varios volumes)
    • Vías con rosca de 10 mL
    • Vías de HPLC de 2 mL
    • Xiringas de polipropileno desbotables de 5 mL
    • Filtros de xiringa de celulosa rexenerada (RC), 0,45 µm de tamaño de poro, 13 mm de diámetro interno, Minisart
    • Micropipetas variables de 10-100 µL, 100-1000 µL
    • Puntas de micropipetas desbotables de polipropileno
    • Xiringa de HPLC de 50 µL, Agilent Technologies
    • Columna de HPLC Hypersil Gold C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm de tamaño de partícula), ThermoFisher Scientific

3.3. Instrumentación

A instrumentación empregada foi a seguinte:

    • Balanza analítica, Kern ABS 320-4N
    • Baño de ultrasóns, P-Selecta
    • Axitador vórtex, IKA MS1 Minishaker
    • Sistema de HPLC Agilent 1220 Infinity LC, Agilent Technologies

Figura 2. Equipo de HPLC-UV/Vis empregado neste traballo

3.4. Mostraxe e preparación de mostras

As mostras analizadas neste traballo tomáronse ao longo do mes de maio de 2019 en supermercados da contorna do CIFP Politécnico de Santiago no concello de Santiago de Compostela. Para este estudo seleccionáronse un total de seis bebidas con gas, correspondentes aos seguintes dous grupos: bebidas sen azucre e bebidas enerxéticas. Entre as bebidas sen azucre elixíronse a versión light e zero dunha popular marca de refrescos de cola e a versión zero dunha popular marca de tónica. Entre as bebidas enerxéticas seleccionáronse as dúas principais marcas deste tipo de bebidas, unha delas na súa versión sen azucre, e unha marca branca dun popular supermercado nacional. As mostras foron gardadas baixo refrixeración (aproximadamente 4 ºC) ata a súa análise. Na táboa 1 indícanse as mostras seleccionadas, o seu volume e os analitos presentes de acordo coa súa etiquetaxe.

Táboa 1. Mostras seleccionadas

As mostras abríronse o día da súa análise e cada unha delas someteuse ao seguinte procedemento:
1. Verteuse un volume de aproximadamente 50 mL nun vaso de precipitados de 100 mL e introduciuse nun baño de ultrasóns durante 30 min co fin de acelerar a súa desgasificación.
2. Levouse a cabo unha dilución da mostra desgasificada coa propia fase móbil do HPLC como diluínte. A dilución empregada foi a seguinte:

    • Refrescos: 1/20 (v/v)
    • Bebidas enerxéticas: 1/50 (v/v)

3. Procedeuse á filtración da mostra diluída, mediante un filtro de xiringa de celulosa rexenerada de 0,45 µm de tamaño de poro. O filtrado foi recollido directamente nunha vía de HPLC de 2 mL.

Figura 3. Filtración da dilución das mostras

3.5. Separación cromatográfica e detección

As análises leváronse a cabo no equipo de HPLC indicado anteriormente, que consta dunha bomba isocrática, un sistema de inxección manual tipo Rheodyne cun bucle de 20 µL e un detector de ultravioleta-visible (UV/VIS) de lonxitude de onda variable.

Para a separación dos analitos optouse pola cromatografía en fase reversa, empregando unha columna cunha fase estacionaria de octadecilsílice (C18). A elución realizouse en modo isocrático cunha fase móbil formada por auga/acetonitrilo/ácido acético glacial en proporcións 86,9 %/13,0 %/0,1 % (v/v/v), respectivamente. O fluxo de fase móbil empregado foi de 1,0 mL/min e a separación levouse a cabo a temperatura ambiente. A detección dos analitos realizouse a unha lonxitude de onda (λ) de 214 nm, cunha velocidade de mostraxe de 5 Hz. O tempo total da análise fixouse en 10 minutos.

3.6. Preparación de disolucións stock

As disolucións stock preparáronse a partir dos estándares sólidos indicados anteriormente. Para este fin, os disolventes que se ían empregar deixáronse termostatizar na sala de balanzas durante 1 hora antes da súa utilización. Empregouse auga grao HPLC como disolvente para todos os compostos, agás a sacarina, que se disolveu en etanol grao HPLC. As disolucións foron preparadas directamente en vías de 10 mL con rosca.
 
Para cada un dos compostos pesouse na balanza analítica unha cantidade próxima aos 20 mg que foi anotada con exactitude. A continuación, engadíronse 10 mL de disolvente cunha micropipeta de 10 mL e anotouse a súa masa e a temperatura na sala de balanzas. Finalmente, as disolucións axitáronse nun axitador tipo vórtex ata a completa disolución dos sólidos e foron gardadas baixo refrixeración a 4 ºC. As concentracións dos estándares foron calculadas a partir dos valores das pesadas e a densidade á temperatura de traballo do disolvente empregado.

3.7. Preparación das disolucións de traballo

A partir das disolucións de stock preparáronse os seguintes estándares empregando a fase móbil do HPLC como diluínte:

    • Estándares individuais das seguintes concentracións: cafeína, 5 µg/mL; acesulfamo K, 5 µg/mL; sacarina, 5 µg/mL e aspartamo, 10 µg/mL.
    • Estándar mestura dos catro analitos de concentración: cafeína, 100 µg/mL; acesulfamo K, 100 µg/mL; sacarina, 100 µg/mL e aspartamo, 200 µg/mL.

Os estándares da calibración preparáronse a partir da mestura anterior a niveis de concentración de 0,20, 1,0, 2,0, 5,0 e 10,0 µg/mL para todos os analitos, agás o aspartamo cuxos niveis de concentración foron 0,40, 2,0, 4,0, 10 e 20 µg/mL. Estes estándares foron preparados directamente en vías de HPLC de 2 mL empregando a fase móbil do HPLC como diluínte.

4. Resultados e discusión

4.1. Separación e identificación dos analitos

Dadas as diferenzas existentes nos espectros de UV dos analitos considerados, optouse por seleccionar unha lonxitude de onda de compromiso na que se obtiveran sinais de absorbancia máis ou menos similares para todos eles. Finalmente, tomando como referencia os resultados publicados por Fernandes et al. (2013), decidiuse traballar a una λ de 214 nm.

Durante a optimización da separación cromatográfica empregáronse distintas fases móbiles formadas por proporcións variables de auga e acetonitrilo, e en todos os casos se engadiu un 0,1% (v/v) de ácido acético glacial.

Na cromatografía en modo isocrático non é posible modificar a composición da fase móbil durante a elución, o que supón unha gran desvantaxe cando se pretende separar analitos con polaridades bastante diferentes, como neste caso. Por esta razón, buscouse unha proporción de acetonitrilo que permitise a elución dos analitos máis apolares dentro dun tempo razoablemente curto, pero que presentase unha forza eluotrópica suficientemente débil como para lograr unha retención suficiente daqueles compostos máis polares. Finalmente, a mellor separación acadouse cunha proporción de acetonitrilo dun 13% (v/v).

Co fin de determinar a orde de elución dos analitos nestas condicións, analizouse de maneira individual cada un deles. Tomáronse os estándares individuais preparados anteriormente (5-10 µg/mL) e inxectáronse 20 µL. Nestas condicións, o acesulfamo K foi o primeiro en eluír, seguido pola sacarina, a cafeína e, ao final, o aspartamo.
Logo de identificar os catro analitos, inxectouse unha mestura destes a un nivel de concentración de 1 µg/mL (2 µg/mL para o aspartamo). No cromatograma da figura 4 pode observase a separación lograda nestas condicións, así como a boa simetría dos picos obtidos.

Figura 4. Cromatograma obtido para unha disolución patrón de 1 µg/mL

Na táboa 2 recóllense tempos de retención (TR), anchuras de pico, factores de capacidade (k´) e o número de pratos teóricos (N) para cada un dos analitos estudados. Para a sacarina, a cafeína e o aspartamo, os factores de capacidade atopáronse dentro do rango considerado xeralmente como axeitado (1< k´<10), mentres que para o acesulfamo K presentou un factor de capacidade inferior a 1. Isto denota unha menor retención deste analito debido a súa maior polaridade. Non obstante, a súa retención é aínda suficiente para poder ser determinado satisfactoriamente mediante esta técnica.

Táboa 2. Parámetros cromatográficos

A partir destes datos calculouse a resolución (Rs) para cada par de picos consecutivos e obtivéronse os valores que se mostran na táboa 3. Como pode observarse, a resolución obtida foi en todos os casos superior a 1,5, valor que garante unha separación a liña base de picos consecutivos.

Táboa 3. Resolución cromatográfica para os picos consecutivos

4.2. Estudo da linealidade

Logo de optimizar a separación cromatográfica, analizáronse os estándares de calibración preparados anteriormente. Despois de integrar os correspondentes cromatogramas, levouse a cabo unha regresión lineal polo método de mínimos cadrados sen ponderación. Na figura 5 poden verse as rectas de regresión obtidas deste xeito para cada un dos analitos.

Figura 5. Rectas de calibración obtidas

Como pode comprobarse, as rectas de calibración amosaron boas linealidades no rango de concentracións seleccionado, con valores do coeficiente de determinación (R2) que variaron desde 0,9986 para o aspartamo ata 0,9995 para o acesulfamo K.

4.3. Cuantificación das mostras

A continuación, analizáronse as mostras de refrescos e bebidas enerxéticas seguindo a metodoloxía indicada. Na táboa 4 móstranse as concentracións atopadas nestas bebidas para cada un dos analitos.
 
Entre os edulcorantes artificiais analizados, o acesulfamo K foi cuantificado en todos as bebidas sen azucre, cunha concentración que variou desde os 125 µg/mL ata os 204 µg/mL. O aspartamo estivo presente nos dous refrescos de cola sen azucre, mentres que a sacarina se atopou unicamente no refresco de tónica sen azucre, a un nivel de concentración de 59,3 µg/mL.
En canto á cafeína, esta foi determinada en todas as bebidas consideradas agás no refresco de tónica. A súa concentración variou desde os 92,2 µg/mL para o refresco de cola zero ata os 406 µg/mL para a bebida enerxética de marca branca. Dentro das bebidas enerxéticas, as concentracións variaron entre os 288 µg/mL e os 406 µg/mL.

Estes datos de concentración foron empregados para calcular a cantidade de cafeína presente en cada unha das latas e comparala cos valores teóricos declarados pola empresa produtora. A partir desta información, calculouse o valor de recuperación do método empregado, como unha estimación da súa exactitude. Os valores de recuperación calculados foron satisfactorios en todos os casos: variaron desde o 95 % para o refresco de cola zero ata o 106 % para a bebida enerxética de primeira marca.

Táboa 4. Resultados obtidos para as mostras analizadas

Conclusións

• Neste traballo de investigación presentouse a posta a punto dunha metodoloxía baseada en HPLC-UV para a análise de cafeína e tres edulcorantes de uso habitual en refrescos sen azucre e bebidas enerxéticas.

• A separación cromatográfica acadada nestas condicións foi satisfactoria xa que se logrou a separación a liña base de todos os analitos nun tempo inferior aos 10 minutos.

• Obtivéronse boas linealidades no intervalo de concentración 0,400 – 20,0 µg/mL para o aspartamo, e 0,200 –10,0 µg/mL para o resto dos analitos.

• A aplicabilidade desta metodoloxía demostrouse mediante a análise de varias mostras reais tomadas en supermercados da contorna do CIFP Politécnico de Santiago.

• Desde o punto de vista didáctico, a realización desta práctica permite afondar nos fundamentos e na práctica da técnica de HPLC para a análise de compostos orgánicos.

Agradecementos

Os autores queren agradecer ao Departamento de Química do CIFP Politécnico de Santiago a súa colaboración e apoio, e ao alumnado do módulo de Análise Instrumental (curso 2018/19) na súa modalidade modular, a súa enorme motivación durante a realización desta práctica.